החל מהתקופה הפרסית הפכה לוד למרכז חשוב לקהילה היהודית. בתקופה ההלניסטית, המקבילה בחלקה לתקופה החשמונאית, המלך הסלווקי דמטריוס הראשון (שלט בין השנים 150-161 לפנה”ס) הציע להפריד את מחוז לוד מהשומרון ולהעבירו ליהודה. יש להניח שהצעה זו התבססה על רוב יהודי בקרב תושבי העיר. לוד נמסרה על ידי השליטים הסלווקים ליונתן הכהן הגדול והיא הפכה לבירת טופרכיה ביהודה. בתקופה זו היישוב עבר לראשונה דרומה – לאזור בו נמצאים כיום כנסיית סנט ג’ורג’, מסגד אל עומרי וחאן אל חילו. בתקופה זו חשיבותה של העיר עולה ואוכלוסייתה מגיעה כנראה לכ-2,500 תושבים. ממצאים בעיר ובסביבתה מעלים את האפשרות שהאזור היה אזור כפרי מיושב בצפיפות יחסית ואוכלוסייתו הייתה יהודית בעיקרה.
